Растения рода Hypericum являются широко используемыми лекарственными растениями, продуцирующими целый ряд ценных вторичных метаболитов. В каталоге природных соединений (Dictionary of Natural Products, 1997) описано 116 идентифицированных и химически охарактеризованных соединений, выделенных из различных видов рода Hypericum, а только из вида Hypericum perforatum (Зверобой продырявленный) выделено и идентифицировано более 50 биологически активных соединений.
Показана антибактериальная активность экстрактов зверобоя продырявленного в отношении грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов, в том числе и некоторых штаммов бактерий, проявляющих устойчивость к известным антибиотикам. Причем основной бактерицидный эффект обусловлен гиперфорином, кстантонами, кумаринами и др. Гиперицин и псевдогиперицин высокоэффективны в ингибировании инфекций, вызываемых различными вирусами, как, например, вирус герпеса (HSV-1 и HSV-2), вирус гепатита С, цитомегаловирус и др. Гиперицин также проявляет противоопухолевую активность в отношении клеточных линий HL-60 лейкемии человека, ЕМТ6 опухолевых клеток молочной железы, клеток U937 миеломы и др.
Высокий спрос на природные продукты из растений рода Hypericum для фармацевтической промышленности стимулировал исследование по разработке биотехнологических приемов их получения. Согласно данным ряда исследователей, основные вторичные метаболиты (гиперицин, псевдогиперицин, гиперфорин, флавоноиды, таннины), синтезируемые интактными растениями, продуцируются также побеговыми, каллусными и суспензионными культурами.
Полученная нами изолированая культура Hypericum perforatum обладает высокой биосинтетической активностью. Среди синтезируемых каллусной культурой компонентов обнаружены гиперицин, псевдогиперицин и гиперфорин.
Целью настоящей работы являлось изучение антибактериальной и противоопухолевой активности экстрактов из полученных нами каллусных тканей Зверобоя продырявленного, а также других видов рода Hypericum — Н. scabrum и Н. alpirnm.
Для выявления антимикробного действия соединений использовались методы, основанные на способности этих соединений диффундировать в толщу агара и задерживать рост или убивать микроорганизмы, находящиеся в зоне диффузии. Если тест-организмы чувствительны к данным соединениям, то после инкубации вокруг лунок образуются зоны отсутствия роста. Зона в 3 см и более свидетельствует о высокой чувствительности микроорганизма к антимикробным агентам. Для проверки антибактериальной активности экстрактов каллусных тканей и интактных растений исследуемых видов зверобоя в качестве тест-организмов использовались Escherichia coli, Staphylococcus aureus и Bacillus subtilis.
Согласно полученным данным ни каллусные ткани, ни интактные растения как Н. perforatum, так и Н. alpinum не ингибировали рост E.coli, а экстракт каллусной ткани Н. scabrum образовывал зону отсутствия роста в 3,5×3,3 см. В отношении S. aureus и В. subtilis антибактериальную активность проявляли экстракты как каллусных тканей, так и интактных растений исследуемых видов зверобоя, причем активность экстрактов из каллусных тканей была выше.
Были выявлены различия в сроках появления зон отсутствия роста тест-микроорганизмов. Если уже через 18 часов инкубирования В. subtilis с исследуемыми образцами наблюдалась четкая зона отсутствия роста, то при инкубировании Е. coli и S. aureus эти зоны проявлялись через 1-3 суток.
В Центре профилактики особо опасных инфекций М3 РА было проведено тестирование экстрактов каллусных тканей и интактных растений Я. perforatum, Н. scabrum и Я. alpinum на антибактериальную активность по отношению к Yersinia pestis Ol, Y. enterocoli-tica, Vibrio cholerae. Экстракты как каллусных культур, так и интактных растений Я. alpinum ингибировали рост всех трех испытанных видов патогенных микроорганизмов, в отличие от Я. perforatum и Н.scabrum, у которых только экстракты каллусов показывали четкое ингибирование роста этих микроорганизмов. Причем ярко выраженные зоны отсутствия роста проявлялись на третьи сутки инкубирования.
Согласно литературным данным для каждого класса соединений существуют различные методы экстракции (Eloff, 1998). В наших опытах было выявлено, что наибольшую антимикробную активность проявляли водные экстракты каллусных тканей и интактных растений по сравнению с их метанольными и этанольными экстрактами.
Проведено также тестирование каллусных тканей зверобоя, выращенных на различных средах, на противоопухолевую активность in vitro. Образцы экстрактов каллусных тканей и интактных растений H. perforatum, Н. scabrum и Н. alpinum были апробированы в Центре нейровирусологии и биологии рака (Филадельфия, США).
Полученные результаты свидетельствуют, что экстракты из каллусных тканей Зверобоя продырявленного проявляют высокую противоопухолевую активность в некоторых линиях раковых клеток. По результатам (в том числе и по секвенированию белка), полученным в указанном Центре, в каллусных тканях Н. perforatum выявлен не известный ранее пептид. Было показано, что противоопухолевая активность экстрактов каллусных тканей обусловлена име
нно этим белком, а не гиперицином, как предполагалось ранее. Интересно, что ни в интактных растениях Н. perforatum, ни в образцах каллусных тканей и интактных растений Н. scabrum и Н. alpinum этот белок обнаружен не был. На рисунке показаны астроциты линии U87MG раковых клеток костного мозга человека до и после обработки белком (фотографии сделаны в Центре нейровирусологии и биологии рака).
Возможность синтеза в изолированных культурах новых соединений, отсутствующих в материнском растении, является одной из наиболее интересных особенностей метода культуры изолированных тканей и объясняется изменением генетической информации, индуцируемым условиями культивирования in vitro (Носов, 1994; Daugall, 1979).
Таким образом, показано, что полученные нами каллусные культуры Н. perforatum. Н.scabrum и Н. alpinum синтезируют соединения с антибактериальной активностью, которые или отсутствуют в интактных растениях, или синтезируются в них в меньших количествах, чем в культуре in vitro. В каллусной ткани II. Perforatum, кроме того, синтезируется новый белок, обладающий противоопухолевой активностью.
Выражаем глубокую благодарность Манрикяну М.Г. (Центр профилактики особо опасных инфекций МЗ РА) и Саркисян Н.С. (Center for Neurovirology and Cancer Biology, Temple University, Philadelphia, USA) за оказание помощи в проведении данной работы.